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荧光分光光度计是属于分光光度计的一种，在生物化学、生物医学、环境化工等部门的应用较为广泛，荧光分光光度计是对经光源激发后产生荧光的物质或经化学处理后产生荧光的物质成份分析的仪器物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的，在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱。荧光分光光度计的工作原理就是根据这一现象设计的，是由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。

二、荧光分光光度计构成

随着科技的进步带动着生产工艺技术的提升荧光分光光度计的从手控式荧光分光光度计发展到自动记录式荧光分光光度计以及现在的计算机控制式荧光分光光度计都是有以下几部分组成。

1、光源

一般是为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，所以更为常用。

2、激发单色器

作为筛选特定的激发光谱器是置于光源和样品室之间，也称喂单色器。

3、发射单色器

作为筛选特定的发射光谱器也成为第二单色器，是至于置于样品室和检测器之间。常采用光栅为单色器

4、样品室

用于盛放样品的空间，通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。样品不同时光源与检测器的角度有所不同，测量固体样品是直角，测量液体样品时锐角。

5、检测器

作为光信号放大的同时还是将光信号转化为电信号。一般是用光电管或光电倍增管作检测器。

三、荧光分光光度计使用方法

（一）实验前准备工作

1、实验所需样品若是液体时，要检查浓度范围是否合适，是否需要稀释，以及所需要的溶剂类型以及稀释倍数。

2、实验所需样品若是固体时，要产看是否为均匀粉末、片状、是否可直接测定等。

3、检查电源电压是否符合设备要求，以及接地设施是否连接。

4、查看环境是否符合设备工作所需环境要求，环境温度应在20℃±5℃;相对湿度不大于70%;电源稳定，无磁场、电场干扰。

5、测试前设备要进行预热

（二）操作步骤

1、在之前的准备工作完成后，接通电源，然后打开主机开关[much]后打开光源开关。

注意：要根据使用说明来启动计算机。并且要进行预热。

2、预热完成够，按照说明查看是否需要对设备进行校准。

注意：仪器一般是在20天内必须从新进行一次激发校准和发射校准

3、.基本测定

①荧光激发光谱测定

设置仪器参数，扫描发射波长，找到max λ ex、max λ em，以此为发射波长，记录发射强度作为激发波长的函数，便得到激发光谱。

②荧光发射光谱测定

设置仪器参数，扫描激发波长，找到max λ ex、max λ em，以此为激发波长，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱。

③差谱测定

设置仪器参数，选择合适的工作方式，测定背景溶液的发射光谱并储存起来，在一定的工作方式下，扫描样品溶液的发射波长，得到当时的光度值和储存的背景值之间的差示值，即差谱。

④峰面积积分

选择适当的工作方式，对样品溶液进行积分操作，即得到峰面积积分。

⑤荧光强度

选择合适的测量参数，设置λ ex、λ em，采用定点读数或扫描方式，即可测得所选波长处的荧光强度。

⑥定量测定

配制一系列已知浓度的标准溶液，在一定的测定条件下，设置λ ex、λ em，按照由稀至浓的次序，测定标准溶液的荧光强度，绘制荧光强度浓度的工作曲线，不改变仪器参数测定未知溶液的荧光强度，由工作曲线即可求出未知溶液的浓度。

4、分析结果

①荧光激发光谱、发射光谱以及其他光谱由仪器控制电脑直接绘出。

②峰面积积分、荧光强度由仪器控制电脑计算显示。

③定量测试：在相同的测定条件下，测定一系列已知浓度的标准溶液的荧光强度，绘制出荧光强度-浓度的工作曲线。浓度未知的溶液的荧光强度测定后，由工作曲线求出该溶液的浓度。

四、荧光粉光光度计使用注意事项

（一）日常注意事项

1、开机时，请先开氙灯电源，再开主机电源。注意开机顺序。

2、每次开机后请先确认两边排热风扇是否工作正常如发现风扇有故障，应停机检查。

3、主机工作时顶部排热器温度很高，切勿触摸以免受伤。

4、请尽量减少不必要的氙灯触发次数，避免氙灯在高压下反复触发。关闭氙灯电源后，若要重新使用，请等待60秒以后重新触发。

5、运行未知浓度的样品测试时，灵敏度设置请从低位向高围( 0-7)逐步设置。

6、当操作者错误操作或其他干扰引起微机错误时，应该立即关断主机电源重新启动，但无须关断氙灯电源。

7、单色器内用螺丝紧固处不得松动。

（二）其他注意事项

1、所需溶液要是已经配置好要查看在低温冰箱里的存放的时间是否超过一星期，如果已超过则需从新配置。

2、实验所用的样品池是四面透光的石英池，拿取的时候用手指掐住池体的上角部，不能接触到四个面，清洗样品池后应用擦镜纸对其四个面进行轻轻擦拭。

3、在测试样品时，注意荧光强度范围的设定不要太高，以免测得的荧光强度超过仪器的测定上限。

4、实验结束后及时的清理台面，处理废液，清洗和放置好样品池，将下次要用的溶液放回冰箱。

5、清洁仪器外表时请勿使用乙醇等有机溶剂，请勿在工作中清洁。不使用时请加防尘罩要保持比色皿的清洁。

五、荧光分光光度计选购指南

1、首先要考虑品牌以及代理商信誉以及售后服务，不仅关系到仪器的质量稳定性，还关系到以后的维修服务。

2、然后要关注仪器的狭缝(光谱带宽)，狭缝还决定了仪器的分辨率，良好的分辨率可以分辨间隔很小的波峰。

3、仪器的信噪比是一项非常重要的参数，它一定程度上反映仪器的检出能力。

4、波长[accuracy]度和重复性也是一项比较重要的指标。

5、扫描速度虽然也很重要，但这和需求有关系，如果对时间没有太多的要求，可以不必在意。

6、综合以上进行对比选购性价比较为高的。

六、荧光分光光度计与其他分光光度计不同点

相同点：比色皿、检测器、记录仪这些基本一样

不同点：光源，是否需要色剂

紫外、可见分光光度计在紫外区使用氢灯或氘灯，在可见光区使用氘灯或溴钨灯。它们发出的都是连续光谱，通过三棱镜（中档）、光栅（**）、滤光片（低级）等分光，这样两种灯组合基本涵盖了紫外-可见光的波长范围。

荧光分光光度计由氙弧灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发光单色器变成单色光后，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照射于测样品用的光电倍增管上。

紫外-可见分光光度计可用于大部分有色物质的定量监测，通常需要使用各种各样的显色剂。荧光分光光度计可用于测试发光材料的发射光谱＼激发光谱＼时间扫描，不需要显色剂。